细胞膜染色

①　新鲜取材的组织标本并收集细胞，以小鼠脾脏标本为例（需要70μm的筛网过滤），在培养皿中加入小鼠淋巴细胞分离液研磨脾脏并过滤；

②　将过滤后的研磨液立即转移至加有RPMI 1640 培养基的离心管中；

③　在室温条件下，每管加入1×红细胞裂解液3mL，移液管轻柔吹打脾脏组织细胞，室温裂解5 min后常温350 g离心 5 min后弃去上清；

④　每管加入 PBS缓冲液重悬细胞，并稀释成终浓度为 106-107 cells/mL的细胞悬液，移液管轻柔吹打后置于4℃备用；

⑤　如需要添加封闭剂，单细胞悬液样本在进行表面抗体染色前，加入1μg/100μL Fc受体阻断剂，轻柔混匀，4℃温度下孵育5-10min，不需要洗涤，即可进行后续染色步骤；

⑥　将带有荧光素的抗体分别加入含有100μL单细胞悬液的细胞流式管中（建议106/μL），4℃条件下避光反应 30 min；

⑦　加入适量的PBS缓冲液进行涡旋洗涤，350g离心5 min后弃去上清；

⑧　加入500μL 细胞染色缓冲液至离心管中，重悬细胞后上机检测并进行数据分析。

细胞胞内染色

①　新鲜取材的组织标本并收集细胞，以小鼠脾脏标本为例（需要70μm的筛网过滤），PBS缓冲液冲洗后置于离心管中，加入RPMI 1640培养基待用；

②　每管加入 1×红细胞裂解液3mL，移液管轻柔吹打脾脏组织细胞，室温裂解5 min后，常温350 g离心 5 min后弃去上清；

③　每管加入 PBS缓冲液重悬细胞，并稀释成终浓度为106-107 cells/mL的细胞悬液，轻柔吹打后置于4℃备用；

④　使用Zombie染料稀释液，室温避光染色15 min，离心弃上清，使用1mL PBS缓冲液洗涤2次；

⑤　使用4%多聚甲醛固定液重悬细胞，旋转孵育固定15 min，再使用1mL PBS缓冲液洗涤1次；

⑥　甲醛/Triton法：使用Triton X-100破膜液重悬细胞，旋转孵育破膜 15 min，离心弃上清；

⑦　单细胞悬液样本在进行抗体染色前，加入1μg/100μL Fc受体阻断剂，轻柔混匀，4℃温度下孵育1h，不需要洗涤，即可进行后续染色步骤；

⑧　将带有荧光素的抗体分别加入含有100μL单细胞悬液的细胞流式管中，4℃条件下避光反应 30 min；

⑨　加入适量的 PBS缓冲液进行涡旋洗涤，350g离心5 min，弃去上清；

加入500μL 细胞染色缓冲液至离心管中，重悬细胞后上机检测并进行数据分析。